近日，《Nature communications》发表了一项关于结核分枝杆菌DNA修复机制的重要研究，首次揭示了DNA诱导的Ku蛋白寡聚化是细菌非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）修复的核心机制。在这项工作中，研究团队借助FIDA（层流诱导分散分析）技术，首次在近生理溶液环境中完整解析了Ku-Mtb蛋白结合DNA进而发生寡聚化组装的全过程，为阐明细菌NHEJ的分子机制提供了重要的实验证据。
01. 研究速览
DNA双链断裂修复是细菌维持基因组稳定的关键过程。结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis, Mtb）依靠Ku蛋白介导的非同源末端连接（NHEJ）完成DNA损伤修复。然而Ku蛋白如何介导 DNA 突触组装（synapsis）并在非同源末端连接的DNA修复通路中怎样发挥功能尚未得到解析。本研究借助包含FIDA在内的多种生物物理学技术，结合结构-功能-动力学多维分析，得到核心结论：
(1) Ku-Mtb蛋白寡聚化由DNA驱动并形成丝状寡聚复合物。
(2) Ku-Mtb蛋白的丝状寡聚体组装是细菌非同源末端连接过程中引发DNA突触组装的核心。
(3) 抑制Ku蛋白寡聚化能够阻断DNA修复，进而削弱细菌在宿主体内胁迫环境中的生存能力。
02. FIDA技术：如何推动机制解析？
本研究的关键环节——DNA结合诱导Ku蛋白发生寡聚化组装——正是通过FIDA技术实现的。研究人员采用FAM荧光标记DNA在溶液环境下实现了：
(1) 精确表征蛋白寡聚：FIDA通过测定蛋白-DNA复合物流体力学半径随蛋白浓度梯度升高而发生的变化，完整表征了DNA结合驱动的Ku蛋白寡聚化全过程。
(2) 直观且完整的数据展示：FIDA技术能够明确区分Ku蛋白-DNA的两步结合并表征二次结合过程中发生的高阶寡聚，并提供Rh与亲和常数双重定量数据。
(3) 维持蛋白天然活性：液相环境保留蛋白自然生理构象，还原真实分子互作行为。
(4) 交叉验证DNA诱导Ku蛋白发生寡聚化：FIDA技术测定的复合物粒径变化与质量光度法（Mass photometry）测定的复合物分子量变化在两个不同维度双重验证Ku蛋白寡聚化发生机制，数据真实可靠。
03. FIDA数据在本研究中的具体展示
随着DNA溶液中加入Ku-Mtb蛋白浓度的升高，Ku-DNA复合物Rh先下降后急剧升高，对应Ku-DNA结合的两步反应：Ku-Mtb与DNA首先发生高亲和力结合（表观Kd纳摩尔级别），引发蛋白质构象压缩，造成Rh下降（绿色曲线）；随后，已形成的Ku-DNA基础复合物发生低亲和力寡聚组装（表观Kd处于微摩尔级别），复合物Rh持续增大（紫色曲线）代表蛋白丝状复合物不断延伸（原文附图8）。
附图8：左：质量光度法分析中的分子量-对比度校准曲线。右：Ku-Mtb蛋白与DNA结合所形成复合物的流体力学半径变化。
为了进一步研究该寡聚化过程，研究人员提升了溶液体系中Ku-Mtb浓度并采集了更多数据。随着Ku浓度增加，复合物Rh持续上升。值得注意的是，在Ku浓度逐步升高过程中，复合物Rh出现若干特征平台，这些平台对应的分子粒径与 Ku‑Mtb‑DNA 复合物的理论预测尺寸一一匹配。继续提高Ku蛋白浓度，Rh进一步增大，说明Ku的寡聚化组装动态过程还在持续（原文图3）。
图3A: Ku-DNA结合的质量光谱检测。随着Ku:DNA比例的升高，可观测到分子量逐步增大的Ku-DNA复合物峰，图上方对应复合物结构模型。
图3B：FIDA实验展示DNA存在时复合物流体力学半径随Ku蛋白浓度升高的变化。因该反应不属于 1:1 结合模式，图中未做拟合曲线；各个Rh平台期分别对应冷冻电镜所观测到的不同复合物结构。
04. 为何选择FIDA？
本研究之所以能明确解析DNA驱动的Ku蛋白寡聚化机制，正是因为FIDA技术具有以下独特优势：
(1) 免固定或修饰：在溶液中直接分析天然状态下的蛋白-DNA互作与蛋白寡聚。
(2) 高分辨率寡聚分析：可分辨多步结合与高阶寡聚，定量展现粒径变化与亲和常数。
(3) 微量样本、高通量：适合结构生物学珍贵样品与多浓度梯度实验。
(4) 动态复杂体系兼容：可完整表征多组分动态寡聚的生物组装全过程。
05. 研究启示与FIDA的应用前景
该研究不仅解析了结核分枝杆菌非同源末端连接（NHEJ）通路中DNA驱动Ku蛋白寡聚化组装的分子机制，提出了靶向抑制Ku寡聚的抗结核病新药策略，更展示了FIDA技术在复杂生物分子互作研究中的强大能力。
未来，FIDA技术可广泛应用于：
新药物靶点的开发
蛋白-蛋白、蛋白-小分子互作定量
复合物组装与解离动力学研究
抗体—抗原、受体—配体互作表征
随着FIDA等技术在动态互作研究中的深入应用，将会有更多生命活动的“调控密码”被一一破解。
06. FIDA：看见相互作用的动态真相
什么是FIDA？FIDA可在溶液体系中测定结合亲和力，无需固定化处理，也不存在表面相关伪影。对于从头设计的结合分子，这意味着可以直接在未纯化或经过热处理的裂解液中测定解离常数Kd；检测采用96孔板形式，所需体积为纳升至微升级别。因此，设计产物可从表达阶段直接得到亲和力排序结果，中间无需纯化步骤。每次检测还可输出流体力学半径，在同一轮实验中即可提示聚集或自缔合现象。
* 相关文献：Zahid et al., Oligomerisation of Ku from Mycobacterium tuberculosis promotes DNA synapsis. Nature communications (2025). DOI: 10.1038/s41467-025-65609-y
* 本文转载自「FIDA分子互作」微信公众号
▍更多应用案例与技术支持： FIDA源自于丹麦哥本哈根，基于独特的层流分散分析技术，对生物分子进行精准表征。同时从粒径，荧光以及光谱位移三个维度检测分子间亲和力，并且独特的质控体系始终贯穿于检测过程，使生物分子的检测不再盲人摸象，精准把控过程中的每一个变化。 作为FIDA的授权代理商，上海昊扩将为您的分子互作与稳定性分析研究，提供先进的仪器设备及专业的技术支持服务。→ 如需了解更多应用案例或技术细节，欢迎联系：李冬平 189-1814-1219 |
