外泌体（Exosomes）是由内体衍生的小型脂质纳米颗粒，直径约 30-200 纳米，大多数活细胞会通过胞吐作用主动分泌外泌体[1]。无论是在病理还是生理状态下，外泌体的释放既可以是持续性的，也可以是诱导性的，且释放过程具有动态性、可控性和功能相关性。外泌体的分子组成与释放量取决于其来源细胞的状态。外泌体可从多种细胞系、原代培养物中分离获得，也可从血清、血浆、唾液等生物体液中提取。鉴于来源的多样性，外泌体具有多效的生理功能，且越来越多的研究表明，其在癌症、感染性疾病、神经退行性疾病等多种病理状态中发挥着重要作用。因此，外泌体成为液体活检方法中的关键研究对象[2]。此外，外泌体还可通过工程改造，成为极具潜力的药物递送载体[3]。
由于外泌体体积微小，从复杂的生物基质中分离外泌体颇具挑战性，且分离产量通常较低。在此背景下，Simple Western™成为研究外泌体的理想技术：该方法仅需 3 微升样品，且具备皮克级灵敏度，大幅减少了传统Western blot对所需外泌体量的要求。随后，可使用针对外泌体相关抗原的特异性检测抗体对之进行表征分析 —— 这些目标抗原既可以是外泌体的通用标志物，也可以是其来源细胞或体液所特有的标志物。本实验方案中，我们将利用市售的外泌体标准品和抗体，通过Simple Western™检测外泌体的通用标志物和来源特异性标志物。
本篇文章介绍以“人血浆、人血清、人A549细胞（肺泡基底上皮腺癌细胞）”三种外泌体标准品为对象，验证下表中抗体的有效性的结果：
01. 通用外泌体标志物的表达
• Flotillin-1：作为经典通用标志物，在三种标准品中均检测到（图1A）。
• Alix：在三种标准品中均有表达，但A549细胞来源外泌体中表达量更高（图1D）。
02. 来源特异性标志物的表达
• Annexin V：作为凋亡标志物与血液抗凝蛋白，在A549细胞、血浆来源外泌体中检测到，在血清来源外泌体中未检测到（图1B）。
• EGFR（HER1）：仅在A549细胞来源外泌体中检测到，血清、血浆来源外泌体中无信号（图1C）。
图 1 利用Simple Western™测外泌体目标抗原。A：flotillin-1；B：Annexin V；C：EGFR；D：Alix。
03. 特殊处理需求的标志物
• CD63：仅当用PNGase F（去糖基化酶）处理外泌体标准品后，才可检测到信号，提示糖基化修饰对该标志物检测的影响（图2）。
04. 其他标志物验证
表2中其余抗体（如Annexin A2、HSPA8/HSC70、TSG101等）均通过Simple Western验证，可在对应外泌体标准品中检测到目标信号（图2）。
图2. 在血浆和 A549 细胞来源的外泌体标准品中，各目标抗原的检测泳道视图。
—— Simple Western技术核心价值 ——
(1) 微量高效：仅需3-5μL外泌体裂解液（传统WB需50μL+），适配珍贵样本；毛细管全流程减少样本损耗，适合低丰度膜蛋白。
(2) 高灵敏度：皮克级检测下限，可测CD63/Alix等，经PNGase F处理破解糖基化干扰，实现EGFR等特异性检测。
(3) 抗基质干扰：12-230kDa毛细管电泳去杂，外泌体裂解后可直接上机，无需繁琐纯化。
(4) 多重定量：单样本同步测8个靶点，符合MISEV标准，动态范围覆盖6个数量级。
(5) 自动化流程：3小时全自动化出结果，减少蛋白降解；每孔独立质控，满足外泌体制备QC。
(6) 精准定量：支持绝对/相对定量，低样本量+高重复性，适配液体活检标志物开发，加速科研到临床转化。
* 参考文献:
1. Exosomes, D M Pegtel and S J Gould, Annual Review of Biochemistry, 2019, 88:487–514.
2. Extracellular vesicles – biomarkers and effectors of the cellular interactome in cancer, J Rak, Frontiers in Pharmacology, 2013, 4:21.
3. Exosomes as reconfigurable therapeutic systems, R Conlan, S Pisano, M Oliveira, M Ferrari and I Mendes Pinto, Trends in Molecular Medicine, 2017, 23(7):636–650.
* 本文转载自「ProteinSimple」微信公众号
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