近年来随着基因编辑技术的发展及在农作物育种领域的应用，相对于传统育种周期的8-10年，基因编辑育种可将育种周期缩短至3年左右，并可快速精准创制新的种质资源，有效提高作物产量、抗病虫害特性及品质性状等。比如基因编辑的水稻品种亩产提高15%以上、油酸含量达到80%以上的基因编辑大豆、产量提高10%以上的基因编辑玉米、抗除草剂小麦、强化甜度的草莓、强化风味的蔬菜等。全球范围内，基因编辑已经在水稻、玉米、大豆、小麦和番茄等农作物以及猪、牛、羊等农业动物中广泛应用，糯玉米、高油酸大豆、抗褐变马铃薯、高GABA番茄、抵抗褐变的蘑菇等基因编辑产品陆续在美国、日本等国家上市推广。

基因编辑技术用于农业动植物育种可以说是我们打赢种业翻身仗，开展种源 “卡脖子” 技术攻关的一把利剑，但由于之前对基因编辑是否属于转基因存在争议，且转基因品种监管方面一直面临着诸多挑战，我国正式的监管制度和法规一直未能出台，限制了基因编辑育种商业化。对基因编辑生物的监管基本沿用《农业转基因生物安全管理条例》框架。其实基因编辑的主要目的是改变作物原有的部分基因，达到基因敲除或对蛋白表达水平进行微调，⽽不是导⼊外源基因，简单来说就是重组，而⾮添加。CRISPR基因编辑技术更是在2020年获得了诺贝尔化学奖。中国科学院院士李家洋表示“基因（组）编辑是国际育种界正在竞争的制高点。如果杂交育种是1.0版本，分子标记育种是2.0，转基因育种是3.0，那么基因（组）编辑育种就是4.0版本。”

好消息是随着今年我国新的《种子法》颁布及世界种业市场简化基因编辑作物监管的大方向，2022年1月24日，中国农业农村部制定公布了《农业用基因编辑植物安全评价指南（试行）》，对我国基因编辑生物育种技术研发与产业推动具有里程碑意义。今年6月8日，农业农村部官网发布重磅通知《国家级转基因大豆品种审定标准（试行）》，《国家级转基因玉米品种审定标准（试行）》已经印发，这都预示着基因编辑育种及转基因大豆玉米商业化在即！

农业用基因编辑植物安全评价指南里全面涵盖了申报程序、靶基因相关情况、基因编辑方法、靶基因编辑情况、载体序列残留情况、脱靶情况、安全证书申请所需要的资料等方面。相信这份安全评价指南，将大大加快基因编辑育种商业化进程！

而转基因大豆玉米品种审定标准涵盖了转化体真实性， 转基因目标真实性（抗除草剂，抗虫）及回交转育的转基因品种三个方面。其中关于回交转育的转基因品种的审定标准为：

转基因品种的受体品种已通过审定，基本性状与受体品种无显著性差异，试验平均产量较受体品种增产≥0.0%；采用 SSR 分子标记方法检测，除转化体导入所致位点差异外，转基因品种与受体品种 DNA 指纹检测差异位点数＜2个。

时至今日基因编辑技术的发展和应用可以说是日新月异，势头正猛。基因编辑效率及遗传转化率都在不断提高，脱靶率在持续降低，我国科学家也发现了新的工具酶Cas12i、Cas12j、Cas12a等，解决了国外Cas9的专利限制问题，在农业用植物育种及基因治疗领域都有非常广阔的应用前景。

那么CRISPR基因编辑技术的原理是什么？如何开展基因编辑工作？一个流程需要多长时间？过程中都要用到哪些工具？作为生命科学工具制造商的LGC Biosearch technologies又可以提供哪些产品和解决方案呢？

CRISPR/Cas9技术是继锌指核酸酶(zinc-fingernuclease, ZFN)、转录激活样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)等技术后最为重要的基因改造技术，可以在基因敲入、基因敲除、基因激活、基因沉默、表观遗传修饰及3D基因结构改变中进行广泛的应用。我们可以发现第1-4步首先要设计需要编辑的基因位点，也就是我们说的靶基因。简单来说CRISPR基因编辑技术是一把科学精准的剪刀，但要用在哪里，还要我们精准解码基因信息，挖掘、定位控制优良性状的可以进行基因编辑的靶基因，这是基因编辑的第一步，也是最重要的基础。有道是 “万事开头难”，当前，科研人员大量工作仍在基因挖掘阶段，这也是基因编辑工作最大的难点之一。

LGC Biosearch Technologies 专有的KASP™基因分型技术通过SNP及Indel分子标记进行基因初定位及精细定位，助力关键主效功能靶基因定位及克隆，并帮助全基因组关联分析后的候选基因功能验证，使我们的育种家不断丰富可用于基因编辑的靶基因库，解决基因编辑的“开头难”问题。目前相关发表文献有千余篇，涉及到水稻、玉米、小麦等主粮作物，及番茄、黄瓜、大白菜等蔬菜作物，还有花生、油菜、大豆等经济作物的抗病虫害、产量及品质相关基因，应用前景广泛。

第5步为基因编辑及载体构建，这个过程通常需要4天左右。 其主要利用CRISPR RNA（crRNA）与转录激活 crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退⽕形成的复合物特异识别基因组序列，引导 Cas9 核酸内切酶在⽬的⽚段⽣成 DNA 双链断裂，这个识别复合体可以通过融合crRNA 与 tracrRNA 序列形成 sgRNA（single-guided RNA）进⾏简化。除了体外转录sgRNA 外，现在我们也可以通过化学合成的方法合成sgRNA，并在合成过程中添加化学修饰，以减少核酸酶降解，提高整体编辑性能，提高其转化效率。该方法具有高效便捷、脱靶效应低、编辑效率高、无细胞毒性等优势，逐渐成为基因编辑基础科研实验的绝佳选择。LGC Biosearch Technologies虽然没有相关的工具酶产品，但可以提供高性价比的各种型号的Mermade 核酸合成仪，可化学合成gRNA、sgRNA等CRISPR基因编辑技术中的关键组分，并可进行硫代和甲氧基等修饰，提高sgRNA的稳定性，降低脱靶效应。

第6-126步（此过程也需要4天左右的时间），断开的DNA双链在同源重组（HR）作⽤下，供体质粒上的⽬标基因及筛选标记（或其他遗传元件）在断裂处被整合进基因组，完成DNA单碱基或片段编辑更改（此步为可选项，也可以不添加目标基因，只将目标片段敲除，创制突变体）。然后进行转化/转染并进行基因编辑个体基因型检测从而筛选基因编辑成功的个体。目前农业上主要采用农杆菌或基因枪侵染。这个过程中LGC Biosearch Technologies 可以提供专业高性价比的用于CRISPR sgRNA 文库构建及质粒克隆的感受态细胞，被多篇文献报道过，其中也包括冷泉实验室的CRISPR 慢病毒 gRNA libraries程序。在国内也有大量客户在使用。

目前主要采用PCR技术来进行基因编辑个体及在第二代去掉外源载体或抗性基因（去标签）后的基因型检测。相对于测序来说，PCR成本更低，检测周期更短，KASP基因分型技术因其低成本高通量的特点也越来越多用于基因编辑流程中的基因型检测。

具体引物设计方法为：在基因编辑序列或外源载体序列上设计一对引物，正向引物5’端加入FAM接头序列，然后在看家基因上设计另一对引物，其正向引物5’端加入HEX接头序列。这样我们通过KASP终点法PCR，就可以对基因编辑的个体进行定性分析，如果是非基因编辑的个体，则只有看家基因被扩增，所以只能检测到HEX荧光（如下图红色的分群），而基因编辑成功的个体则同时带有FAM和HEX两种荧光（如下图绿色的分群）。

* 本文转载自LGC基因组学公众号